摘要：棉花（Gossypium hirsutum L.）黄萎病是棉花生长过程中最具毁灭性的病害之一。国内外研究者运用各种育种手段培育出抗病品种，取得了一定的进展，但仍无应用于生产实践的高抗黄萎病陆地棉品种。分析了抗病育种工作中存在的问题，综述了棉花抗黄萎病在转基因育种方面的研究进展，指出了利用转基因技术培育棉花抗病品种是目前防治黄萎病最有效而可行的方法。 
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　　关键词：棉花（Gossypium hirsutum L.）；抗黄萎病；转基因育种 
　　中图分类号：S562；S435.621 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5673-03 
　　棉花（Gossypium hirsutum L.）产业是我国的支柱产业之一，为广大棉农每年带来400亿～600亿元的直接经济收入，为城镇提供近3 000万个就业岗位。棉花生产的发展关系到国计民生，地位举足轻重。在阻碍我国棉花生产可持续发展的诸多因素中，棉花黄萎病的危害是其主要因素之一。 
　　1 棉花黄萎病的危害 
　　棉花黄萎病是世界毁灭性病害，病原菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahlia Kleb），自从传入我国以来，危害逐年蔓延和加重。1993年黄萎病暴发成灾，全国棉花发病面积270万hm2，遍及各主要产棉区[1，2]；2003年棉花黄萎病流行面积达320万hm2，造成2.3亿kg的皮棉产量损失[3]。据中国农业科学院植物保护研究所的研究，7月下旬前发病平均减产高达66.9%，7月下旬后发病平均减产仍达20.3%。早期遭受落叶型和急性萎焉型黄萎病危害时，容易造成棉株死亡导致绝收。 
　　2 棉花抗黄萎病转基因育种的研究进展 
　　棉花黄萎病属土传维管束病害，病原菌寄主范围广，并存在明显的致病力分化现象，防治困难。在综合防治措施中，化学防治很难奏效并易造成环境污染；生物防治技术虽然表现出良好的应用前景，但因生防因子专化性太强而制约了该技术的推广应用；对于重病田，不得不轮作倒茬，但仍不能彻底解决问题。惟一经济、有效、环保的防治措施是使用抗病棉花新品种。在国家的高度重视和大力支持下，棉花生产用种的品种改良得到长足发展，但从现有育成品种来看，仍不能满足棉花生产的现实需求，兼备丰产、优质、多抗、广适的棉花新品种极少，尤其是没有兼抗棉花黄萎病的新品种。究其原因，主要是因为陆地棉遗传基础狭窄，种内缺乏优良的抗病资源。马存等[4]曾对中国现存的近5 000份棉花品种资源进行抗黄萎鉴定，高抗黄萎病的材料均为海岛棉或野生棉，1 512份陆地棉资源中，没有发现免疫或高抗黄萎病的材料，抗黄萎病的也仅占0.8%。利用常规技术对陆地棉进行抗病性遗传改良时，存在周期长、效率低、性状间负向连锁累赘难以克服等困难。所以仅仅依靠传统育种技术实现抗黄萎病等多个育种目标聚合的难度较大。随着植物抗病分子生物学的发展，利用各种抗病基因或诱发抗病基因以增强植物抗病性，在各种作物分子改良中得到广泛应用，抗病分子育种的条件已趋于成熟，为寻找棉花抗病基因、创制新的抗源材料开辟了新途径。 
　　利用基因工程和遗传转化技术针对棉花抗黄萎病正在进行的研究方向有：①棉花抗黄萎病基因的定位和克隆。如Ve1基因首先从欧薄荷中克隆得到[5]，随后在番茄[6]、陆地棉[7]中都进行了功能验证，证明其对棉花黄萎病具有显著抗性；最近在拟南芥中克隆得到的AHL19基因与棉花黄萎病的抗性存在很大关联性[8]。②棉花分解脱氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）酶基因的克隆。棉花体内酚类物质主要可分为棉酚（Gossypol，G）、半棉酚（Hemigossypol，HG）、脱氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）等，已经证实其中HG和dHG的含量受黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染诱导，并且对黄萎病菌有一定的毒性[9]。许多科学家希望能克隆此基因，然后利用反义基因技术，抑制该酶的含量，从而达到培育抗黄萎病棉花品种的目的。③分离黄萎病病原菌的毒素，克隆该毒素基因，进一步分离棉花中的解毒酶。研究证明黄萎病菌致萎毒素主要是酸性糖蛋白，这种糖蛋白毒素破坏了棉株的组织结构，引起萎蔫甚至死亡[10]。④分离系统获得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）中起关键作用的基因，利用诱导性抗性培育抗病品种。植物在病原菌“激发子”（Elicitor）的诱导下产生过敏性反应（HR），一系列防卫相关基因的表达也随之变化，使得这种抗性水平逐渐扩展到整株，形成对病原菌侵染的广谱抗性[11]。 
　　目前应用的基因主要有几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防卫素、硫素及葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GO）等外源抗病基因，并已获得转基因抗病棉花株系[12]。蔡应繁等[13]利用基因枪法、叶盘法和花粉管通道途径等基因工程技术将抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因导入棉花，经PCR检验，得到阳性结果。吴家和等[14]把几丁质酶和葡聚糖酶通过根癌农杆菌转入陆地棉品种冀合321和中棉所35基因组，获得了转基因棉花，经过检测，7个转化株均表现出不同程度的抗黄萎病或耐黄萎病特性。乐锦华等[15]将菜豆中的几丁质酶和烟草中的葡聚糖酶基因转入棉花，并筛选出了高抗黄萎病的品系。齐俊生等[16]利用棉花黄萎病菌强致病力落叶型V991菌系的毒素诱导高抗黄萎病的海岛棉品种，获得一个抗黄萎病基因At7，并导入陆地棉，从而培育出高抗黄萎病的新株系。肖月华等[17]从棉花植株中分离克隆了多个具有抗病功能的基因，筛选出抗黄萎病的棉花品种。陈大军等[18]将天麻抗真菌蛋白基因转入天然彩色棉主栽品种，选育出既抗枯萎病又抗黄萎病的兼抗材料。Murray等[19]将来自Talaromycesflavus的GO基因转入棉花，使棉株对根部大丽轮枝菌产生了一定的抗菌活性。刘慧君等[20]将GO基因转入棉花，转基因后代对枯萎病和黄萎病抗性均有显著提高，部分材料抗性达到抗病水平。Degray等[21]通过研究抗菌肽MSI-99在叶绿体基因组中的表达获得了能够高效表达的转基因烟草植株。转基因植株叶片提取物能够抑制曲霉菌（Aspergillus sp.）、镰刀菌（Fusarium sp.）、黄萎病菌等3种真菌孢子的生长，抑菌效果高达95%。此外，Degray等[21]将D4E1基因序列在35S RNA启动子引导下通过农杆菌法转入烟草中，获得了高抗黄萎病的植株，其叶片提取粗蛋白能够抑制99%黄萎病菌的萌发。 　　溶菌酶是一类广泛存在于自然界、对多种革兰氏阳性菌和阴性菌以及某些真菌或病毒具有杀灭作用的水解酶类。中国农业科学院生物技术研究所将蛋清溶菌酶HEWL基因和T4噬菌体溶菌酶基因利用毕赤酵母进行重组表达，发现表达产物对棉花枯萎病菌和黄萎病菌均具有明显的抗性，采用农杆菌介导法将植物表达载体转化陆地棉珂字312以及R15品系，获得了转基因种子，其ELISA、PCR检测表达量较高的有多个株系，从初步筛选的阳性植株中获得多株高抗黄萎病菌的棉株，其中，繁殖后命名为DHGH-1和T4GH-1的棉株已进入安全评价中间试验。 
　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种有益的土壤细菌，具有发达的分泌系统、很强的环境适应性和抗逆性，能分泌多种抗菌物质。中国农业科学院生物技术研究所从枯草芽孢杆菌菌株B111中提取得到抗菌蛋白BS2，其对棉花黄萎病菌、枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水稻条斑病菌（Bacterial leaf streak）、白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）等病原菌均具有抗性，尤其对棉花落叶型黄萎病菌具有较强的抑制作用，但对毕赤酵母无影响。将该蛋白酶基因导入酵母中获得有效表达，重组蛋白同时具有蛋白酶活性和抗菌活性。同时，利用枯草芽孢杆菌的内生性特性将该菌株定殖在棉株中，能有效促进棉株发育，提高棉株的抗病性和棉花产量。 
　　在棉花转基因育种技术方面，主要有花粉管通道法、基因枪轰击法、农杆菌介导法3种方法。目前农杆菌介导法转化因再生体系比较成熟，能转移人工分离和修饰过的外源基因，成功率高，外植体的适用范围广，转化的外源基因以单拷贝或双拷贝为多数，遗传稳定性好，是棉花上应用最广泛的遗传转化系统[22]。农杆菌介导法生产转基因棉花所用的选择标记基因有nptII、hpt、Bar基因等；转化的目的基因包括抗虫、抗除草剂、抗病、抗逆、雄性不育、提高油酸含量和纤维品质改良等基因；外植体包括子叶、下胚轴、子叶节、叶柄、茎尖和胚性愈伤组织等。中国农业科学院还建立了棉花转基因技术体系平台，通过将农杆菌介导法、基因枪轰击法、花粉管通道法的有效整合，达到了每年转化8 000株的规模。 
　　3 结语 
　　通过转基因生物技术将抗黄萎病基因转移到陆地棉中，创造抗性强的棉花新材料，可望从根本上解决陆地棉黄萎病抗原严重缺乏的问题，也必将为棉花抗黄萎病育种开拓广阔的前景。 
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